CRISPR-Cas9: genų redagavimo revoliucija ir etika

Anksčiau aptarti genų inžinerijos metodai, nors ir galingi, buvo palyginti lėti, sudėtingi ir ne visada tikslūs. Tačiau pastaraisiais metais biologijos mokslą sudrebino nauja technologija, kuri pakeitė viską. Tai – CRISPR-Cas9 sistema.

Įsivaizduokite tekstų rengyklės funkciją „rasti ir pakeisti“. Dabar įsivaizduokite, kad šią funkciją galite pritaikyti gyvybės kodui – DNR. Būtent tai ir leidžia daryti CRISPR. Tai yra universalus, palyginti paprastas, pigus ir neįtikėtinai tikslus genomo redagavimo įrankis, leidžiantis mokslininkams iškirpti, įterpti ar pakeisti DNR sekas bet kurioje norimoje genomo vietoje.

Ši technologija atveria kvapą gniaužiančias galimybes gydyti genetines ligas, kurti naujas augalų veisles ir suprasti fundamentalius gyvybės procesus. Tačiau kartu ji kelia ir sudėtingus etinius klausimus apie ribas, kurių neturėtume peržengti. Šioje pamokoje išnagrinėsime, kaip veikia ši revoliucinė sistema, kokį vaidmenį jos atradime suvaidino Lietuvos mokslininkas prof. Virginijus Šikšnys, ir aptarsime didžiules jos galimybes bei pavojus.

Paradoksalu, tačiau vienas moderniausių genų inžinerijos įrankių buvo atrastas tiriant vienus seniausių organizmų – bakterijas. CRISPR-Cas9 sistema iš tiesų yra bakterijų adaptacinė imuninė sistema, skirta apsisaugoti nuo jas puolančių virusų (bakteriofagų).

CRISPR (angl. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) – tai specifinės, pasikartojančios DNR sekos bakterijos genome. Tarp šių pasikartojimų yra unikalios DNR atkarpos, vadinamos tarpikliais (angl. spacers). Būtent šie tarpikliai ir yra sistemos esmė – tai yra virusų DNR fragmentai, likę po ankstesnių infekcijų. CRISPR lokusas veikia kaip „ieškomų nusikaltėlių“ (virusų) DNR duomenų bazė.

Cas baltymai (angl. CRISPR-associated proteins) – tai baltymai (fermentai), susiję su CRISPR sekomis. Svarbiausias iš jų yra Cas9, kuris veikia kaip programuojamos DNR „žirklės“ – nukleazė, galinti kirpti DNR.

Kaip veikia bakterijų imunitetas:

1. Adaptacija: Kai virusas pirmą kartą infekuoja bakteriją, Cas baltymai iškerpa nedidelį viruso DNR fragmentą ir įterpia jį kaip naują tarpiklį į CRISPR lokusą. Taip bakterija „įsimena“ priešą.
2. Raiška: Nuo CRISPR lokuso nuolat nurašoma RNR (pre-crRNR), kuri yra sukarpyta į trumpas CRISPR RNR (crRNR). Kiekviena crRNR turi vieno iš tarpiklių (viruso DNR) seką.
3. Interferencija: crRNR susijungia su Cas9 baltymu ir veikia kaip gidas, nuvesdamas jį prie atitinkamos DNR sekos. Jei tas pats virusas vėl bando infekuoti ląstelę, gido RNR pagal komplementarumo principą atpažįsta viruso DNR. Cas9 baltymas sukerpa viruso DNR, taip jį neutralizuodamas.

📸 Iliustracija per Google Vaizdus: Trijų etapų schema, iliustruojanti CRISPR-Cas9 veikimą bakterijoje: 1) Adaptacija (viruso DNR fragmento įterpimas). 2) Raiška (crRNR sintezė). 3) Interferencija (Cas9 su gido RNR suranda ir sukarpo viruso DNR).

Mokslininkai suprato, kad šią bakterijų sistemą galima „nulaužti“ ir pritaikyti genų redagavimui bet kuriame organizme. Tam tereikia sukurti dirbtinę gido RNR (gRNR), kuri atitiktų norimą redaguoti DNR seką (taikinį), ir kartu su Cas9 baltymu įvesti ją į ląstelę.

Kaip veikia CRISPR-Cas9 kaip genomo redagavimo įrankis:

1. Taikinio atpažinimas: gRNR nuveda Cas9 baltymą į tiksliai nurodytą genomo vietą.
2. DNR kirpimas: Cas9 baltymas kerpa abi DNR grandines, sukeldamas dvigrandį trūkį.
3. Ląstelės DNR taisymo mechanizmai: Ląstelė bando „sutaisyti“ atsiradusį DNR trūkį. Būtent šį taisymo procesą mokslininkai ir išnaudoja genomo redagavimui:
   • Geno „išjungimas“ (knock-out): Ląstelė naudoja greitą, bet netikslų taisymo būdą (NHEJ), kurio metu dažnai atsiranda mažų insercijų ar delecijų. Jos sukelia poslinkio rėmelio mutaciją ir sugadina geną, taip jį išjungdamos.
   • Geno „pataisymas“ arba įterpimas (knock-in): Kartu su CRISPR-Cas9 sistema į ląstelę įvedama ir „taisyklės“ DNR atkarpa-šablonas. Ląstelė, naudodama tikslesnį taisymo būdą (HDR), įtaiso šį šabloną į kirpimo vietą, taip pataisydama mutavusį geną arba įterpdama naują geną.

Prof. Virginijaus Šikšnio indėlis

Vilniaus universiteto profesorius Virginijus Šikšnys su savo komanda buvo vieni iš pirmųjų pasaulyje, kurie 2011-2012 m. pademonstravo, kad CRISPR-Cas9 sistemą galima perprogramuoti ir panaudoti tiksliam DNR kirpimui in vitro. Nors 2020 m. Nobelio chemijos premija už šios technologijos išvystymą atiteko Emmanuelle Charpentier ir Jennifer Doudna, prof. V. Šikšnio darbai yra fundamentaliai svarbūs ir plačiai pripažįstami pasaulio mokslo bendruomenėje kaip lygiagretus ir nepriklausomas atradimas.

Genų inžinerija egzistavo ir iki CRISPR. Mokslininkai jau dešimtmečius naudojo metodus, tokius kaip ZFN (Cinko pirštų nukleazės) ir TALENs, kad redaguotų genomus. Tačiau šios ankstesnės technologijos, palyginti su CRISPR-Cas9, buvo tarsi akmens kirvukas palyginti su lazeriniu skalpeliu. CRISPR sukėlė revoliuciją dėl kelių esminių priežasčių:

Šis technologinis šuolis demokratizavo genų inžineriją. Anksčiau genomo redagavimas buvo prieinamas tik kelioms specializuotoms, dideles lėšas turinčioms laboratorijoms. Dabar tai gali atlikti beveik bet kuri molekulinės biologijos laboratorija pasaulyje. Būtent šis prieinamumas ir galia kartu sukėlė ir didžiulį entuziazmą, ir gilų susirūpinimą dėl etinių pasekmių.

CRISPR atradimas nebuvo vieno žmogaus nuopelnas, o ilgas ir laipsniškas procesas, kuriame dalyvavo daugybė mokslininkų iš viso pasaulio, atlikusių fundamentalius tyrimus.

CRISPR technologija atvėrė Pandoros skrynią, priversdama visuomenę spręsti sudėtingus etinius klausimus. Diskusijos centre yra riba tarp dviejų galimų taikymo sričių.

Somatinių ląstelių genų terapija (gydymas)

Tai genų redagavimas paciento kūno (somatinėse) ląstelėse, siekiant išgydyti ligą. Pavyzdžiui, iš paciento, sergančio pjautuvine anemija, paimamos kraujo kamieninės ląstelės, laboratorijoje ištaisomas mutavęs hemoglobino genas ir ląstelės grąžinamos pacientui.

• Etinis vertinimas: Laikoma etiškai priimtina ir perspektyvia sritimi. Poveikis apsiriboja vienu individu ir nėra paveldimas. Tai iš esmės yra pažangi medicininė procedūra, panaši į organų transplantaciją.
• Naujausi tyrimai: Jau vyksta klinikiniai tyrimai su žmonėmis gydant pjautuvinę anemiją, beta talasemiją, kai kurias vėžio formas ir įgimtą aklumą. 2023 m. pabaigoje Jungtinėje Karalystėje ir JAV buvo patvirtintas pirmasis pasaulyje CRISPR pagrindu sukurtas vaistas (Casgevy) pjautuvinei anemijai ir beta talasemijai gydyti. Tai yra istorinis momentas, įrodantis technologijos terapinį potencialą.

Lytinių ląstelių (germline) genų redagavimas (tobulinimas ir paveldimumas)

Tai genų redagavimas gametose (kiaušialąstėse, spermatozoiduose) arba embrionuose. Poveikis yra paveldimas ir perduodamas visoms ateities kartoms.

• Etinis vertinimas: Laikoma etiškai nepriimtina ir pavojinga dėl daugelio priežasčių:
  1. Saugumas: Technologija nėra 100% saugi. Netaikininis poveikis gali sukelti nenumatytų mutacijų, kurios būtų perduodamos iš kartos į kartą.
  2. Neatšaukiamumas: Pakeitimai taptų nuolatine žmogaus genofondo dalimi.
  3. „Slidžios nuokalnės“ argumentas: Pradėjus nuo genetinių ligų prevencijos, lengva pereiti prie neesminių požymių „tobulinimo“ (akių spalva, intelektas, raumenys), sukuriant „dizainerių kūdikius“.
  4. Socialinė nelygybė: Prieiga prie šių technologijų galėtų sukurti genetiškai nulemtą socialinę atskirtį.
• Dėl šių priežasčių didžioji dalis pasaulio šalių ir mokslo bendruomenė yra sutarusios dėl moratoriumo žmogaus lytinių ląstelių redagavimui, kuris būtų taikomas reprodukcijai.