Biotechnologijų įrankiai: genų inžinerija ir klonavimas

Atradus DNR struktūrą ir iššifravus genetinį kodą, mokslininkai ėmė svajoti ne tik stebėti, bet ir sąmoningai keisti genetinę informaciją. Biotechnologija – tai mokslo ir technologijų sritis, kuri naudoja gyvus organizmus, ląsteles ar jų komponentus praktiniams tikslams – sukurti naudingus produktus, patobulinti organizmų savybes ar sukurti naujus diagnostikos ir gydymo metodus.

Šiuolaikinės biotechnologijos pagrindas yra genų inžinerija (arba rekombinantinės DNR technologija) – metodų visuma, leidžianti izoliuoti, analizuoti, modifikuoti ir perkelti genus iš vieno organizmo į kitą. Tai leido mums „perprogramuoti“ ląsteles ir paversti jas miniatiūriniais fabrikais, gaminančiais mums reikalingas medžiagas.

Šioje pamokoje susipažinsime su pagrindiniais genų inžinerijos „įrankiais“ ir metodais, kurie sukėlė revoliuciją biologijos moksle: PGR, DNR elektroforeze, restrikcijos fermentais ir klonavimu.

Dažnai mokslininkai turi tik nedidelį DNR pavyzdį (pvz., iš nusikaltimo vietos, archeologinės iškasenos ar paciento kraujo lašo). Norint ištirti šią DNR, jos reikia žymiai daugiau. Polimerazės grandininė reakcija (PGR) – tai metodas, leidžiantis in vitro (mėgintuvėlyje) greitai padauginti specifinę DNR seką milijonus kartų.

PGR procesas yra cikliškas ir susideda iš trijų pagrindinių žingsnių, kurie kartojami 25-35 kartus.

1. Denatūracija (Karštis): Mėginys pakaitinamas iki ~95°C. Aukšta temperatūra nutraukia vandenilinius ryšius ir atskiria dvigrandę DNR į dvi viengrandes matricas.
2. Pradmenų prijungimas (Atvėsinimas): Mėginys atvėsinamas iki ~55–65°C. Prie kiekvienos viengrandės DNR matricos specifiškai prisijungia trumpos sintetinės DNR atkarpos – pradmenys (praimeriai). Jie apibrėžia dauginamo DNR fragmento pradžią ir pabaigą.
3. Elongacija (Sintezė): Temperatūra pakeliama iki ~72°C. Prie pradmenų prisijungia karščiui atsparus fermentas Taq polimerazė (išgrynintas iš karštųjų versmių bakterijos Thermus aquaticus). Ji nuskaito DNR matricą ir sintetina naują komplementarią grandinę.

Po vieno ciklo DNR kiekis padvigubėja. Po ( n ) ciklų DNR molekulių skaičius išauga ( 2^n ) kartų. Po ~30 ciklų iš vienos DNR molekulės gaunama daugiau nei milijardas kopijų.

📸 Iliustracija per Google Vaizdus: PGR ciklo schema. Parodyti tris etapus: 1) Denatūracija: dvigrandė DNR atsiskiria. 2) Pradmenų prijungimas: prie viengrandžių DNR prisijungia praimeriai. 3) Elongacija: Taq polimerazė sintetina naujas grandines. Rodyklė rodo, kad procesas kartojasi.

Padauginus DNR fragmentus PGR metodu, dažnai reikia juos atskirti ir nustatyti jų dydį. Tam naudojamas metodas – gelio elektroforezė.

Principas: DNR molekulės turi neigiamą krūvį (dėl fosfato grupių). Patalpinus DNR mišinį į specialų gelį (dažniausiai agarozės) ir prijungus elektrinį lauką, DNR fragmentai pradeda judėti link teigiamo poliaus (anodo).

• Gelis veikia kaip molekulinis sietas: mažesni DNR fragmentai juda pro gelio poras greičiau ir nukeliauja toliau.
• Didesni DNR fragmentai juda lėčiau ir lieka arčiau starto vietos.

Tokiu būdu DNR fragmentai atsiskiriami pagal dydį. Jų padėtis gelyje vizualizuojama specialiais dažais, šviečiančiais UV šviesoje. Lyginant su žinomo dydžio DNR fragmentų rinkiniu (vadinamu „kopėtėlėmis“), galima nustatyti tiriamų fragmentų dydį.

📸 Iliustracija per Google Vaizdus: Gelio elektroforezės schema. Parodyti gelio plokštelę su šulinėliais, į kuriuos dedama DNR. Prijungtas elektros šaltinis (neigiamas polius viršuje, teigiamas apačioje). Parodyti, kad po elektroforezės DNR fragmentai išsidėstė juostomis: trumpiausi apačioje, ilgiausi viršuje.

Genų inžinerijos esmė – gebėjimas iškirpti geną iš vienos DNR ir įterpti jį į kitą. Tam naudojami molekuliniai „žirklės“ ir „klijai“.

Restrikcijos fermentai (restriktazės)

Tai fermentai, išgryninti iš bakterijų, kurie veikia kaip molekulinės žirklės. Kiekviena restriktazė atpažįsta specifinę, trumpą DNR seką (dažniausiai 4-8 bazių porų ilgio, palindrominę) ir kerpa DNR būtent toje vietoje. Bakterijoms šie fermentai tarnauja kaip apsauga nuo virusų (bakteriofagų) DNR.

• Daugelis restriktazių kerpa DNR grandines ne tiesiai, o palikdamos trumpas viengrandes iškyšas, vadinamas „lipniais galais“. Šie galai yra komplementarūs vienas kitam.

DNR ligazė

Tai fermentas, veikiantis kaip molekuliniai klijai. Jis sujungia DNR fragmentus, sudarydamas fosfodiesterinius ryšius tarp gretimų nukleotidų.

Rekombinantinės DNR kūrimas

1. Iškirpimas: Tas pats restrikcijos fermentas naudojamas iškirpti norimą geną (pvz., žmogaus insulino geną) iš donoro DNR ir „atidaryti“ vektorių – nešiklio DNR molekulę (dažniausiai bakterijos plazmidę).
2. Sujungimas: Kadangi abiejų DNR fragmentų „lipnūs galai“ yra komplementarūs, jie susijungia vandeniliniais ryšiais.
3. Klijavimas: DNR ligazė suformuoja tvirtus fosfodiesterinius ryšius, sukurdama rekombinantinę plazmidę – plazmidę su įterptu svetimu genu.

📸 Iliustracija per Google Vaizdus: Rekombinantinės DNR kūrimo schema. Parodyti, kaip restriktazė iškerpa geną iš chromosomos ir atidaro plazmidę, sukurdama vienodus „lipnius galus“. Tada parodyti, kaip genas įsistato į plazmidę ir DNR ligazė juos sujungia.

Klonavimas biologijoje reiškia identiškų kopijų kūrimą. Priklausomai nuo to, kas kopijuojama, skiriami keli klonavimo tipai.

1. Genų klonavimas

Tai procesas, kurio metu sukuriama daug identiškų rekombinantinės DNR molekulės kopijų. Tai yra standartinis genų inžinerijos etapas:

1. Transformacija: Sukurta rekombinantinė plazmidė įterpiama į bakterijos ląstelę.
2. Dauginimasis: Bakterijos auginamos maistinėje terpėje. Kiekvieną kartą dalijantis bakterijai, kartu pasidaugina ir joje esanti rekombinantinė plazmidė. Taip per trumpą laiką gaunamos milijardai norimo geno kopijų. Vėliau šios bakterijos gali būti naudojamos koduojamam baltymui (pvz., insulinui) gaminti.

2. Terapinis klonavimas

Tikslas – sukurti embrionines kamienines ląsteles, genetiškai identiškas pacientui. Šios ląstelės gali virsti bet kokio tipo audiniu ir būti panaudotos pažeistiems organams atstatyti, išvengiant imuninio atmetimo.

• Metodas: Somatinės ląstelės branduolio perkėlimas (SCNT). Iš paciento somatinės ląstelės paimamas branduolys ir perkeliamas į donoro kiaušialąstę, iš kurios prieš tai buvo pašalintas jos pačios branduolys. Gautas embrionas auginamas iki blastocistos stadijos, iš kurios išskiriamos kamieninės ląstelės.

3. Reprodukcinis klonavimas

Tikslas – sukurti visą organizmą, genetiškai identišką kitam organizmui. Šiuo metodu 1996 m. buvo klonuota avis Dolly.

• Metodas: Naudojamas tas pats SCNT metodas kaip ir terapiniame klonavime, tačiau gautas embrionas yra implantuojamas į surogatinės motinos gimdą ir auginamas iki gimimo. Daugelyje šalių žmonių reprodukcinis klonavimas yra uždraustas dėl etinių priežasčių.

📸 Iliustracija per Google Vaizdus: Supaprastinta avies Dolly klonavimo schema (SCNT procesas).